关于电镜的二三事：透射电镜/免疫电镜样本制备

? ? ? ?样品的超薄切片提供了化学稳定样品的内部结构，用于在TEM中提供图像的各个部分表示三维对象的二维视图。因此，必须对样品的三维超微结构进行深入的研究。同样重要的是，薄切片样品的出现是方案中多个步骤的结果，包括样品的提取、一个或多个化学固定步骤、脱水和包埋、切片和染色。

? ? ? ?一般来说，免疫电子显微镜的应用涉及抗原-抗体复合物的直接电子显微镜成像。为了提高微生物检测的灵敏度和揭示难以捉摸的生物的超微结构，已经开发了广泛的应用。当用于提高检测灵敏度时，抗体可将病毒或细菌聚集在溶液或网格上进行阴性染色。免疫金染色可以与阴性染色相结合，提供一种敏感的技术，可以通过透射电镜识别和可视化单个抗原，并且可以用于生物制剂本身的鉴定[1]。

? ? ? 待处理的材料可以是颗粒，例如病毒或细菌悬浮液、通过离心浓缩成颗粒的细菌或培养的细胞样品、单层细胞培养物、组织块。由于方案中使用的固定剂（即戊二醛、多聚甲醛和四氧化锇）的挥发性和毒性，这些物品应在通风橱中使用乳胶或腈进行处理[2]。

一．组织样本的固定和初始处理[3]

? ? ? 关键的考虑因素是组织样本的大小，必须将其缩小到1mm3或更小。不得超过这一临界尺寸，以确保在初始加工、固定后、整体染色和随后的渗透步骤中固定剂的充分渗透。处理步骤如下：

1. 获取一块新鲜的组织，并尽快用刀片在聚丙烯砧板上将组织切成厚度小于1毫米的碎片。在切片过程中，最好用少量的TEM初级固定剂覆盖组织。
2. 将几小块组织放入装有新制备的TEM初级固定剂的固定小瓶中，其体积至少是组织块体积的20倍。
3. 将组织在室温下培养60分钟，然后将其移至4℃冰浴60分钟。或者在4℃下固定过夜。
4. 从小瓶中倒出固定液，用4℃预冷的新鲜磷酸盐/蔗糖冲洗缓冲液，在30分钟内多次清洗组织。

1.2 固定后染色

（1）将组织块放在四氧化锇中，于4℃固定90分钟。固定后过程中经常摇晃组织块，或将小瓶低速放置在平台摇床上，以促进四氧化锇渗透到组织中。

（2）固定后，将溶液倒入通风橱中的废物容器中。在冷冻磷酸盐/蔗糖冲洗缓冲液中冲洗组织块两次，然后在冷蒸馏水中冲洗六次，以去除磷酸盐缓冲液。

（3）染色组织整体在醋酸铀酰染色溶液中放置90至120分钟，在4℃条件下周期性搅拌。或者在0.5%醋酸铀酰水溶液中染色，在4℃下放置过夜。

（4）在冷蒸馏水中洗涤组织三次以去除醋酸铀酰。

1.3 脱水并包埋组织

（1）通过乙醇系列脱水，依次用以下溶液替换孔中的溶液，每次10分钟：50%乙醇，4℃；75%乙醇，4℃；95%乙醇，室温；100%乙醇，室温。

（2）用丙酮或环氧丙烷浸泡三次，每次浸泡10分钟，嵌入环氧树脂中。

二．细胞颗粒的固定和初始加工[4]

? ? ? ?该类样品涵盖从用于分离和繁殖病毒的细胞培养物到生长培养基中的纯细菌培养物。细胞的数量和样管的类型将决定要固定的颗粒的类型，并进行初始样品处理。用于电子显微镜的细胞培养方法多种多样，从用细胞刮板刮单层到通过胰蛋白酶化产生单分散的群体。将这些细胞通过离心浓缩再固定。颗粒材料必须从离心管中取出，根据颗粒的大小和稳定性，它可以作为固体组织处理，也可以将其包裹在琼脂中，以确保样品制备过程后续步骤中的完整性。

2.1 获取颗粒

? ? ? ?在缓冲盐水或无血清培养基中收获细菌或培养细胞，并在硬壁或软壁微型离心管中离心。

2.2 固定单元格

（1）如果样品是在硬壁微量离心管中收集的：小心地去除上清液。在通风橱中，缓慢添加新制备的TEM初级固定剂，其体积至少是颗粒体积的20倍，在4℃固定1小时。

（2）如果样品是在软壁微离心管中收集的：切开含有样品颗粒的微离心管的尖端，并将颗粒与管的末端一起滴入含有新制备的TEM初级固定剂的固定瓶中，其体积至少是颗粒的20倍，在4℃固定1小时。

（3）用磷酸盐/蔗糖冲洗缓冲液更换固定剂，并小心地从微量离心管或切割管尖取出颗粒。

2.3 将细胞包埋在琼脂中并再次固定

（1）如果颗粒的厚度小于1mm：小心地将颗粒转移到2.5%的熔融琼脂（保持在40℃-60℃）沉积在封口膜上，并保持悬浮在琼脂中直到凝固。

（2）如果颗粒的厚度大于1毫米：将颗粒从上到下切成1毫米厚的薄片。为了保持颗粒的完整性，小心地将颗粒切片转移到沉积在封口膜上的熔融琼脂滴中，并将切片悬浮在琼脂中直至其凝固。

（3）用细胞刮刀去除多余的固化琼脂，以增强固定剂和溶剂的交换。（4）将颗粒或切片转移到含有新鲜固定液的固定瓶中，在4℃下再孵育90分钟。

（5）固定后，从沉淀中倒出固定液，在4℃下用磷酸/蔗糖蛋白酶缓冲液代替。在4℃下孵育10分钟，然后更换新鲜磷酸盐/蔗糖蛋白酶缓冲液，在4℃下再孵育10分钟。

2.4 固定后整体染色（与1.2步骤一致）

? ? ? ?卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)拥有专业的科学家和成像实验室，可为包括植物样本、动物样本、细菌和病理标本在内的生物科学和临床研究提供全面的透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）服务。我们经验丰富的专家可以为样品收集、制备和评估提供实验设计指导。我们还提供有关图像和结果的专业病理咨询。

参考文献：

1. Electron Microscopy in Diagnostic Virology[J]. 1987.
2. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications[J].Micron, 2003.DOI:10.1016/0047-7206(79)90088-8.
3. Ohi M , Li Y , Cheng Y ,et al.Negative staining and image classification — powerful tools in modern electron microscopy[J].Biological Procedures Online, 2004, 6(1):23-34.DOI:10.1251/bpo70.
4. Karlyshev A V , Mccrossan M V , Wren B W .Demonstration of polysaccharide capsule in Campylobacter jejuni using electron microscopy.[J].Infection & Immunity, 2001, 69(9):5921-5924.DOI:10.1128/IAI.69.9.5921-5924.2001.

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