【ELISA检测】酶联免疫吸附实验概述-卡梅德生物

? ? ?? ? ?酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合以及抗体或者抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现目标物检测的免疫分析方法，可测至皮摩尔（pmol）级别。在ELISA技术中，抗原或抗体被结合在固相载体表面，并通过酶标记的方式，利用酶催化特定底物发生显色反应，从而实现对抗原或抗体的定量分析。该技术因其高灵敏度，可测至皮摩尔级别（pmol），在生物医学研究和临床诊断中得到广泛应用。

ELISA原理：

? ? ? ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。首先把已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。然后，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。

ELISA常见类型：

（1）直接法：

? ? ? ELISA直接法中，样品中的抗原或抗体以非特异性方式直接吸附在包被板上。然后，将特异性测定酶标抗体或酶标抗原连接到孔中，孵育后加入底物显色并判读结果，并在读板器上进行量化。

? ? ? 特点：适用于检测小分子抗原，优势：实验步骤少，检测速度快，无须使用二抗可避免交互反应，结果较准确。缺点：没有二级抗体步骤意味着没有信号放大，降低了检测灵敏度。试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。

（2）间接法：

? ? ? ? 否定了对目标特异性共轭测定抗体/抗原的需要，因为共轭的二级抗体只需要对一级抗体具有物种特异性。如果总的样品抗原被结合到包被板上，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。就像ELISA直接法一样，背景噪音仍然是一个问题。然而，如果该检测方法用于检测样品抗体，纯化的目标抗原被涂在板上，而一级抗体来自于样品。这大大减少了背景噪音，因此这些检测方法在确定样品中的抗体滴度时最受欢迎。

? ? ? ? 常用于抗体的检测，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它多的免疫反应性。缺点：可能会发生交叉反应，与直接法比，实验周期长。

（3）夹心法：ELISA夹心法将抗原夹在抗体之间

? ? ? ?类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。

? ? ? ?直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接ELISA的方式进行检测。在夹心ELISA实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。

? ? ? 常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。优点：抗原与检测板的非特异性结合，捕获抗体使其成为一个特异性的过程。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性。且抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

（4）竞争法：

? ? ? ? 首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。

? ? ? ?常测定小分子抗原：如激素和药物之类，也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。优势：可适用不纯的样本，快速高效。 缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

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