透射电镜/免疫电镜样本制备常见问题和解决方案

一、胶体金颗粒没有结合上是什么原因？如何避免？[1]

? ? ? ? 原因：造成这种现象可能是由于抗原的量低；抗体由于滴度低、储存不当或年限较长、稀释不当或过度冷冻和解冻等原因导致的质量问题；溶液的pH值可能过高或呈碱性；严重的阴性染色可能会掩盖金颗粒。

? ? ? ?改善方法：使用更长的孵育时间和更浓缩的初级抗体，还可以通过调节pH或降低负染料的浓度和/使用较大的金颗粒来改善这种情况。

二、电子显微镜检查时涂层不稳定的原因？如何避免？[2]

? ? ? ?原因：由于电子束与薄膜和样品的相互作用而引起的薄膜加热。

? ? ? ?改善方法：随着时间的推移，当电子束穿过栅格时，通过缓慢增加电子束的强度来稳定薄膜；使用真空蒸发器在格栅上再涂一层直接碳。

三、背景金颗粒过多的原因？如何避免？[2]

（1）如果是在塑料薄膜上，则该部分可能没有暴露在溶液中（由于侧面朝上），因此在转移和清洗格栅时要小心，将装有样品的格栅面朝上；（2）抗原在制备过程中受到破坏，使用不同的程序在1%多聚甲醛中进行短链反应；（3）溶液的离子浓度可能很低，提高盐浓度（高达2.5%）。在孵育溶液中添加卵清蛋白、BSA或正常山羊血清（不适用于蛋白A）至约1%。（4）在孵育期间，切片可能没有被充分清洗，增加洗涤步骤；（5）抗体的非特异性电荷吸引可引起背景，在所有溶液中使用1%的洗涤剂（例如，Tween 20）。在所有溶液中加入正常山羊血清（不含蛋白A），一抗培养前正常山羊血清浓度增高。

四、金颗粒发生聚集的原因？如何避免？[3]

? ? ? 原因：一抗混杂，形成团块；聚集可能是由金共轭物的自然放大因子引起。对于IgG-金颗粒偶联物，多达10个偶联金颗粒可以附着在一抗的Fc组分上，在切片上产生团簇的外观，但这种情况一般不会发生在蛋白偶联物上。

? ? ? 改善方法：使用新鲜的抗血清；如有需要，可使用更高稀释度的金颗粒。

五、染色密度太大，无法辨别结构细节怎么办？[4]

? ? ? ? 原因：网格上的污渍太多了；染色浓度过高；调整瞬变电磁加速电压。

? ? ? ?改善方法：滤纸吸附去除污渍，然后在染色过程中去除网格；降低染色浓度；增加加速电压可以降低图像对比度。

六、样品不均匀地分散在网格上怎么办？[4]

? ? ? 因为有支撑膜的栅格往往是疏水的，可以使用润湿剂使网格更疏水；滴入细菌肽（50μg/ml）、poly-L-赖氨酸（1μg/ml）或牛血清白蛋白（0.05%至0.005%w/v）孵育30-60秒；还可以直接将润湿剂添加到样品中以帮助扩散。

七、样本固定剂有哪些种类？[5]

? ? ? ? 戊二醛是一种五碳双醛，它有用性质是能交联蛋白质。新鲜制备的葡二醛在中性pH下也会聚合成长链二醛，它提供可变大小的交联，有效地稳定蛋白质结构。多聚甲醛通常与戊二醛结合，以更好地稳定生物样品。一般来说，当固定剂被鉴定为含有多聚甲醛时，通常意味着它们含有由甲醛的多聚甲醛聚合物产生的甲醛。这种新制备的一碳一醛甲醛在水溶液中反应为亚甲基乙二醇，其优点是其快速渗透特性和聚合和交联蛋白质和核酸的能力，也可以改变脂类的化学性质。丙烯醛是另一种高活性固定剂，通常与其他醛(如戊二醛和/或多聚甲醛)结合使用，用于固定非常致密的样品。

八．透射电镜样本分为哪几种类型？[5]

（1）固体粉末样本：将粒径符合要求的粉末溶解在有机溶剂无水乙醇中，用超声的方法将样品尽可能地分散开，然后用支持网捞起来；（2）大部分的TEM样本是薄膜类的样本，该类样本可以做静态观察，如样本组织内部结构分布，密度，状态等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用。（3）金属类的样本的表面复型，即把需要观察的金属样本的表面形貌（表面显微组织的凹凸情况）用适宜的非晶薄膜复制出来，再对金属样本表面形貌的复制膜进行透射电镜观察与分析，以观察样本组织，断口的外形，表面凹凸情况及磨损程度，二维的形态和分布、及结构分析。

? ? ? ? ?卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)拥有专业的科学家和成像实验室，可为包括植物样本、动物样本、细菌和病理标本在内的生物科学和临床研究提供全面的透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）服务。我们经验丰富的专家可以为样品收集、制备和评估提供实验设计指导。我们还提供有关图像和结果的专业病理咨询。

1. Yongchang C , Fengwei W .Investigation of Proliferation and Differentiation of Gastric Epithelial Cells of Fetal rat by Electronic Microscope and Immunohistochemical Methods[J].JOURNAL OF ZHENJIANG MEDICAL COLLEGE, 1999.
2. Mclean I W , Nakane P K .A new fixative for immunoelectron microscopy[J].Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 1974, 100:405-414.
3. Tremblay, Marie-éve, Riad M , Majewska A .Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy[J].J Vis Exp, 2010(41).DOI:10.3791/2021.
4. Griffiths G , Simons K , Warren G ,et al.Immunoelectron microscopy using thin, frozen sections: application to studies of the intracellular transport of Semliki Forest virus spike glycoproteins.[J].Methods in Enzymology, 1983, 96:466-485.DOI:10.1016/S0076-6879(83)96041-X.
5. Stefan,Geimer,Michael,et al.Centrin scaffold in Chlamydomonas reinhardtii revealed by immunoelectron microscopy.[J].Eukaryotic cell, 2005.

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