细胞培养之一二三：哺乳动物细胞培养相关问题

一．用于哺乳表达系统的哺乳细胞主要类型[1]

? ? ? ?在哺乳动物表达系统中生产重组蛋白的一般过程始于将整合在载体中的重组基因转染到所选细胞中。该基因携带调控转录的结构元件。为了选择将质粒成功整合到基因组中的细胞，还会在相同的质粒或新的质粒中添加一一个选择系统。哺乳动物细胞中最常用的选择标记是谷氨酰胺合成酶（GS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）基因，它们分别只允许转化细胞在缺乏谷氨酰胺和次黄精/胸腺嘧啶的培养基中生长。在转染和选择性生长之后，分离存活的单细胞以产生克隆群体。筛选后，选择最高产和稳定的克隆，并创建细胞系库，用于未来的蛋白质生产。

? ? ? ?（1）CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系是生产许多生物药品的主力，其中大多数是单克隆抗体。CHO细胞来源于中国仓鼠卵巢成纤维细胞。自从最初的克隆产生以来，许多CHO细胞系已经被开发出来。这些细胞具有悬浮生长能力强、产量高、能在无血清培养基中生长等诸多优点。此外，CHO细胞不易受到人类病毒感染，从而降低了生物安全风险。另一方面，CHO细胞也有一些缺点。虽然这些细胞合成的聚糖通常具有“类人”的特征，但也有一些非人类的和潜在的免疫原性结构，如N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。此外，CHO细胞不能产生存在于人糖蛋白中的α(2，6)-唾液酸残基。CHO-k1基因组序列的确定促进了CHO的细胞工程，优化了其作为高效蛋白表达平台的使用是另一种来源于仓鼠的细胞系。它们的使用在VIIa因子、VII因子和疫苗生产中尤为常见。与CHO类似，这些细胞可以表达具有免疫原性末端Neu5Gc和α-gal的聚糖。

? ? ? ? （2）NS0和Sp2/0是源自肿瘤细胞的小鼠骨髓瘤细胞。由于这些细胞系被开发出来，它们已被广泛用于生产商业单克隆抗体。使用这些细胞系的缺点是它们可以产生较高水平的免疫原性聚糖α-gal和Neu5Gc。与仓鼠和小鼠衍生的细胞相反，人类细胞系不产生免疫原性聚糖。另一方面，它们易受人类病毒感染，这就是为什么在从这些细胞和所有细胞生产生物治疗药物时需要进行一系列病毒灭活的原因。

? ? ? （3）HEK293（人胚胎肾293）是一种转染病毒DNA的人细胞系。这是用于蛋白质表达的最突出的人类细胞系，可以清楚地产生人聚糖谱。自其发展以来，已经产生了多种HEK293的变体，例如用于产生因子VII的HKB 11。

二．细胞培养基的开发[1]

? ? ? ?培养基是细胞培养的重要组成部分，它可以简单地定义为支持细胞生长的液体或凝胶，并为细胞提供适量的生长因子、维生素、矿物质、葡萄糖和氨基酸。基本上，培养基分为天然培养基和合成培养基。天然培养基依赖于天然存在的生物材料，包括生物液体，如血清、人胎盘脐带血清和羊水。第二类天然培养基包括组织提取物，如肝脏、脾脏、肿瘤、骨髓、牛胚胎和鸡胚胎提取物。血浆凝块和凝血剂可以是另一种形式的天然培养基。主要的缺点是这些介质的复杂性和不明确的性质，这使得结果的可重复性很差。另一方面，合成或人工介质为研究和开发提供了富有成效的途径。

? ? ? ? 含血清培养基是以胎牛（小牛）血清（FBS）为基础培养基的唯一或主要添加成分，是最常用的培养基之一。一般来说，小动物的血清优于成年动物，因为它含有较少的γ-球蛋白含量，从而诱导较少的抗体相互作用，因此对细胞生长的负面影响较小。血清提供了大量的生物活性成分，包括蛋白质、维生素、矿物质、生长因子和激素，为细胞提供所有必需的营养物质，并促进细胞增殖和改善特定细胞功能。 此外，它还含有几种载体介质，如白蛋白和转铁蛋白，可将各种维生素、激素和亲脂分子输送到细胞中。此外，血清可以通过纤连蛋白的关键作用改善细胞的锚定和对底物的粘附。蛋白酶抑制剂和一些金属（如钙、铁、锌和镁）的存在可以保护细胞免受蛋白质水解。血清是一种粘度增强剂，可以保护细胞免受剪切应力的影响，特别是在悬浮培养中。它还可以作为缓冲剂。

? ? ? ? 血清的主要缺点包括由于批次之间的差异而缺乏可重复性。这种差异是由于血清含有不确定数量的生物活性成分，包括生长因子、微量元素、激素和增殖驱动转录因子。这些成分在不同批次的血清中变化很大，这可能导致细胞生长不一致，并改变细胞对化学物质的反应。血清的另一个重要缺点是伦理方面的考虑，因为通过心脏穿刺从小牛身上收集血清的方法不人道且苛刻，这与痛苦和疼痛有关。有报告指出，每年有超过100万头小牛被宰杀，以获得50万升FBS。经济上，尽管工业公司转向生产用于重组蛋白生产的无血清培养基，但血清成本和需求一直在不断上升。

三.? 糖基化的异质性是如何产生的？它又是如何受到细胞培养条件的影响的[2]？

? ? ? 糖基化的异质性是由多种因素引起的。首先，细胞内的内质网和高尔基体中的细胞过程以及底物的可用性会影响糖基化的异质性。此外，糖基转移酶和糖基水解酶等酶的活性也会对糖基化产生影响。细胞培养条件也会对糖基化的异质性产生影响，包括培养基成分、pH值、搅拌和培养基补充物等。研究表明，这些因素的变化可以改变糖基化的异质性。总之，糖基化的异质性是由细胞内的多种因素和细胞培养条件共同影响的。这些因素包括细胞过程、底物可用性、酶的活性以及培养条件的变化。

四. 细胞系工程是如何通过添加或删除基因来影响合成蛋白质的结构，并进而产生期望的治疗效果的[3]？

? ? ? ? 细胞系工程通过添加或删除基因来影响合成蛋白质的结构，并进而产生期望的治疗效果。通过细胞系工程，可以插入或删除基因，以改善细胞系的产量和性能。例如，可以插入表达生长因子、控制细胞周期、抗凋亡基因和原癌基因的基因，以提高细胞系的产量。此外，还可以通过细胞工程来敲入或敲出参与糖基化途径的酶基因，从而控制糖基化结构。例如，在CHO细胞中敲除fucosyltransferase FUT8基因可以有效产生无岐化抗体，其具有显著更高的抗体依赖性细胞毒性活性。此外，ST6Gal1和β 4GalT1的共表达可以产生高度唾液酸化的IgG，从而可以有针对性地设计糖蛋白的特征，以增强其免疫功能。细胞系工程通过这些方法可以改变蛋白质的结构，从而产生期望的治疗效果。

? ? ? ? 哺乳动物蛋白表达系统适用于科学家对天然构象蛋白的体外重组表达需求，如糖基化修饰，磷酸化修饰等；利用哺乳动物蛋白表达系统，经过高密度发酵技术培养，卡梅德生物的科学家可以做到高达6.3g/L表达水平的重组抗体发酵，适合于重组单抗药物的高水平表达。

? ? ? ? 卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)已建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F 细胞系、Expi 293-F细胞系等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列），能够为客户提供更高表达水平的重组蛋白哺乳动物细胞表达与制备。

参考文献：

1. Róisín O'flaherty, Bergin A , Flampouri E ,et al.Mammalian cell culture for production of recombinant proteins: A review of the critical steps in their biomanufacturing[J].Biotechnology Advances, 2020, 43.DOI:10.1016/j.biotechadv.2020.107552.
2. Prokop A , Prokop Z , Schaffer D ,et al.NanoLiterBioReactor: Monitoring of Long-Term Mammalian Cell Physiology at Nanofabricated Scale[J].MRS Online Proceeding Library Archive, 2004, 820.DOI:10.1557/PROC-820-O5.5/W9.5.
3. ?Quek L E , Dietmair S , Krmer J O ,et al.Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.[J].Academic Press, 2010(2).?DOI:10.1016/j.ymben.2009.09.002.

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